Незадекларированные виды животных в сухих и влажных кормах для собак и кошек на основе новых и гидролизованных белков обнаружены с помощью микроматричного анализа (Ссылка на оригинал статьи)
Предыстория
Неправильная маркировка — важная проблема для людей, которым необходимо контролируемое питание, и недавно эта проблема возникла также в отношении кормов для собак и кошек. В исследовании, проведенном в Великобритании, при тестировании на наличие ДНК крупного рогатого скота, курицы, свиньи и лошади в 17 популярных влажных кормах для домашних животных, приобретенных в супермаркетах, Мэн и соавторы отметили, что корова, свинья и курица были включены в состав 15 продуктов, даже если это явно не указано на этикетках. Аналогичным образом, при тестировании широкого ассортимента кормов для собак и кошек (n = 52), доступных на рынке США (как в розничных, так и в интернет-магазинах), на наличие митохондриальной ДНК восьми различных видов животных (т. е. крупного рогатого скота, коз, овец, кур, гусей, индеек, свиней и лошадей), Окума и Хеллберг обнаружили, что 38,5% кормов для домашних животных были потенциально неправильно маркированы, поскольку либо содержали виды мяса, не заявленные на этикетке, либо не содержали заявленные виды мяса. Образцы кормов для домашних животных, включенные в исследования Мэйна и соавторов и Окумы и Хеллберга, предназначались для содержания собак и кошек. В последнее время особую обеспокоенность вызывает неправильная маркировка кормов для домашних животных, специально разработанных для содержания одного источника белка (новые белковые диеты, NPDs), которые, наряду с гидролизованными белковыми диетами (HPDs), используются в качестве элиминационных диет для диагностики неблагоприятной пищевой реакции (AFR, adverse food reaction) у собак и кошек. Обоснование этих двух диетических подходов четко изложено в обзоре Верлиндена и соавторов.
Поскольку пробный корм является единственным надежным методом диагностики AFR, наличие неуказанных видов животных в НПД и HPDs является серьезной проблемой при кормлении собак или кошек с пищевой гиперчувствительностью непредсказуемо загрязненным продуктом, поскольку любой потенциально аллергенный белок может помешать существенной ремиссии симптомов и ввести врача в заблуждение при диагностике НПР. Элиминационные диеты, как NPD, так и HPD, также используются у собак с хроническими энтеропатиями для диагностики диареи, вызванной кормом (FRD), диареи, вызванной антибиотиками (ARD), и стероид-зависимого заболевания (SRD) на основе реакции собаки на лечение.
При рассмотрении исследований, посвященных наличию загрязняющих веществ в коммерческих элиминационных диетах, Радитич и соавт. использовали метод ИФА для проверки четырех безрецептурных сухих кормов для собак из оленины на наличие сои, птицы и говядины; Риччи и соавт. проанализировали двенадцать сухих кормов для собак, используемых в качестве элиминационных диетических испытаний, с учетом трех зоологических классов (т. е. млекопитающие, птица и рыба), как с помощью ПЦР, так и с помощью микроскопии, тогда как в исследовании Хорват-Унгербека и соавт. ПЦР-тест в реальном времени был использован для семи сухих и пяти влажных кормов для домашних животных для идентификации пяти видов животных (курицы, индейки, говядины, баранины и свинины).
В связи с более высокой стабильностью молекул ДНК по сравнению с белками при воздействии высокой температуры, протоколы на основе ДНК, по-видимому, являются наиболее надежными методами идентификации видов животных в продуктах с высокой степенью переработки, таких как корма для домашних животных.
В трех упомянутых выше исследованиях протоколы, используемые для идентификации видов животных, были трудоемкими и были сосредоточены на обнаружении ограниченного числа видов животных в небольшом количестве образцов кормов для собак, большинство из которых (23 из 28) были сухими.
Целью данного исследования было пролить свет на проблему загрязнения и неправильной маркировки сухих и влажных кормов для домашних животных, используемых в качестве элиминационных диет для диагностики аллергической реакции на пищевые продукты у собак и кошек. В отличие от вышеупомянутых исследований, в текущем исследовании был использован быстрый ДНК-микрочип для обнаружения 19 видов животных за один запуск. Присутствие загрязняющей примеси предполагалось всякий раз, когда с помощью микроматричного анализа обнаруживался вид животного, не заявленный в списке ингредиентов.
Поскольку пробный корм является единственным надежным методом диагностики AFR, наличие неуказанных видов животных в НПД и HPDs является серьезной проблемой при кормлении собак или кошек с пищевой гиперчувствительностью непредсказуемо загрязненным продуктом, поскольку любой потенциально аллергенный белок может помешать существенной ремиссии симптомов и ввести врача в заблуждение при диагностике НПР. Элиминационные диеты, как NPD, так и HPD, также используются у собак с хроническими энтеропатиями для диагностики диареи, вызванной кормом (FRD), диареи, вызванной антибиотиками (ARD), и стероид-зависимого заболевания (SRD) на основе реакции собаки на лечение.
При рассмотрении исследований, посвященных наличию загрязняющих веществ в коммерческих элиминационных диетах, Радитич и соавт. использовали метод ИФА для проверки четырех безрецептурных сухих кормов для собак из оленины на наличие сои, птицы и говядины; Риччи и соавт. проанализировали двенадцать сухих кормов для собак, используемых в качестве элиминационных диетических испытаний, с учетом трех зоологических классов (т. е. млекопитающие, птица и рыба), как с помощью ПЦР, так и с помощью микроскопии, тогда как в исследовании Хорват-Унгербека и соавт. ПЦР-тест в реальном времени был использован для семи сухих и пяти влажных кормов для домашних животных для идентификации пяти видов животных (курицы, индейки, говядины, баранины и свинины).
В связи с более высокой стабильностью молекул ДНК по сравнению с белками при воздействии высокой температуры, протоколы на основе ДНК, по-видимому, являются наиболее надежными методами идентификации видов животных в продуктах с высокой степенью переработки, таких как корма для домашних животных.
В трех упомянутых выше исследованиях протоколы, используемые для идентификации видов животных, были трудоемкими и были сосредоточены на обнаружении ограниченного числа видов животных в небольшом количестве образцов кормов для собак, большинство из которых (23 из 28) были сухими.
Целью данного исследования было пролить свет на проблему загрязнения и неправильной маркировки сухих и влажных кормов для домашних животных, используемых в качестве элиминационных диет для диагностики аллергической реакции на пищевые продукты у собак и кошек. В отличие от вышеупомянутых исследований, в текущем исследовании был использован быстрый ДНК-микрочип для обнаружения 19 видов животных за один запуск. Присутствие загрязняющей примеси предполагалось всякий раз, когда с помощью микроматричного анализа обнаруживался вид животного, не заявленный в списке ингредиентов.
Методы
Отбор проб
На рынке было отобрано 40 образцов кормов для домашних животных (15 сухих и 25 влажных) для собак (n = 36) и кошек (n = 4) 14 различных производителей. Образцы включали отдельные партии 31 корма NPD (9 сухих и 22 влажных) и 9 кормов HPD (6 сухих и 3 влажных). Этикетки кормов для домашних животных тщательно изучались для определения всех источников белка и жира в списке ингредиентов. Из каждого корма отбиралась аликвота массой 50 г, которая отправлялась в лабораторию для идентификации вида животного. Все анализы проводились в лаборатории микробиологии пищевых продуктов Института экспериментальной зоопрофилактики Венеции (Леньяро, Италия).
Идентификация видов животных
Все образцы были обработаны в соответствии с протоколом GeneTop Meat-V kit (GeneTop, Тайвань -R.O.C.). Данная процедура является аккредитованным методом Института ветеринарной экспертизы региона Лацио и Тосканы. Алеандри. Протокол основан на выделении общей фракции ДНК, амплификации специфических ДНК-мишеней с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и последующем анализе ДНК на микрочипах на твердой матрице.
Экстракция ДНК
Аликвоту 200 мг гомогенизированного влажного корма или измельченного сухого корма для животных отбирали в стерильных условиях в двух повторностях для каждого продукта. Образцы обрабатывали для выделения ДНК с помощью набора DNeasy mericon food (QIAGEN, Хильден, Германия) согласно инструкции производителя. Качество и концентрацию ДНК после выделения оценивали с помощью спектрофотометра (спектрофотометр SmartSpec™ Plus, Bio-Rad, США).
Амплификация ДНК и анализ на микрочипах
Реагенты, используемые для амплификации и гибридизации, поставлялись с набором GeneTop Meat-V (GeneTop, Тайвань - R.O.C.). Вкратце, 22,25 мкл смеси Meat-IV и 0,25 мкл Taq переносили в стерильные ПЦР-пробирки, хранившиеся при низкой температуре. Образцы для ПЦР готовили, добавляя 2,5 мкл ранее выделенной ДНК в реакционную смесь. ПЦР проводили на приборе GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystem, США) по следующему протоколу: 2 мин при 94 °C, затем 30 циклов при 94 °C в течение 30 с, при 60 °C в течение 30 с и при 72 °C в течение 30 с. Заключительный этап элонгации проводили при 72 °C в течение 10 мин. Затем амплифицированные образцы хранили при температуре −20 °C до использования.
Анализ с помощью микрочипов
Планшет для микрочипов был разработан для обнаружения 19 видов животных: крупного рогатого скота, буйволов, кошек, кур, собак, ослов, уток, зайцев, рыб, коз, гусей, лошадей, мышей, свиней, домашней птицы, кроликов, крыс, овец и индеек.
Протокол, используемый для идентификации с помощью микрочипов, был предоставлен производителем (GeneTop, Тайвань - R.O.C.). Вкратце, ампликоны, полученные с помощью ПЦР, денатурировали нагреванием до 95 °C в течение 5 мин и 30 с, а затем помещали на лед. Предварительно нагретый (до комнатной температуры) буфер HA пипетировали заранее в каждую лунку чипа Meat-V, и жидкость распределяли по поверхности каждого чипа. В каждую лунку загружали по 5 мкл денатурированных ампликонов, после чего биочип покрывали клейкой пленкой. Биочип затем инкубировали при 50 °C в течение 40 минут в гибридизационном шейкере (1000 об/мин). Гибридизационная жидкость была удалена, а лунки были промыты три раза 200 мкл промывочного буфера. Блокирующий реагент был приготовлен с соотношением StrepAP и буфера B 1:1000, и в каждую лунку было вылито 100 мкл смеси и инкубировано 20 минут при 50 °C. Биочип промывали три раза 200 мкл промывочного буфера, затем добавляли 200 мкл буфера C и выливали. Детекционный буфер, состоящий из 2 мкл NBT/BCIP, смешанных с 98 мкл буфера C (соотношение 1:50), был добавлен в каждую лунку, и биочип был помещен в темноту на 7 минут. Детекционный буфер был удален, а чип был дважды промыт водопроводной водой. Высушенный биочип считывали с помощью ридера GeneTop (GeneTop, Тайвань - R.O.C.) и невооруженным глазом. По данным производителя, чувствительность теста составляет 0,1%. Результаты заносили в таблицу Microsoft Excel (Microsoft Corporation, Редмонд, штат Вашингтон).
На рынке было отобрано 40 образцов кормов для домашних животных (15 сухих и 25 влажных) для собак (n = 36) и кошек (n = 4) 14 различных производителей. Образцы включали отдельные партии 31 корма NPD (9 сухих и 22 влажных) и 9 кормов HPD (6 сухих и 3 влажных). Этикетки кормов для домашних животных тщательно изучались для определения всех источников белка и жира в списке ингредиентов. Из каждого корма отбиралась аликвота массой 50 г, которая отправлялась в лабораторию для идентификации вида животного. Все анализы проводились в лаборатории микробиологии пищевых продуктов Института экспериментальной зоопрофилактики Венеции (Леньяро, Италия).
Идентификация видов животных
Все образцы были обработаны в соответствии с протоколом GeneTop Meat-V kit (GeneTop, Тайвань -R.O.C.). Данная процедура является аккредитованным методом Института ветеринарной экспертизы региона Лацио и Тосканы. Алеандри. Протокол основан на выделении общей фракции ДНК, амплификации специфических ДНК-мишеней с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и последующем анализе ДНК на микрочипах на твердой матрице.
Экстракция ДНК
Аликвоту 200 мг гомогенизированного влажного корма или измельченного сухого корма для животных отбирали в стерильных условиях в двух повторностях для каждого продукта. Образцы обрабатывали для выделения ДНК с помощью набора DNeasy mericon food (QIAGEN, Хильден, Германия) согласно инструкции производителя. Качество и концентрацию ДНК после выделения оценивали с помощью спектрофотометра (спектрофотометр SmartSpec™ Plus, Bio-Rad, США).
Амплификация ДНК и анализ на микрочипах
Реагенты, используемые для амплификации и гибридизации, поставлялись с набором GeneTop Meat-V (GeneTop, Тайвань - R.O.C.). Вкратце, 22,25 мкл смеси Meat-IV и 0,25 мкл Taq переносили в стерильные ПЦР-пробирки, хранившиеся при низкой температуре. Образцы для ПЦР готовили, добавляя 2,5 мкл ранее выделенной ДНК в реакционную смесь. ПЦР проводили на приборе GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystem, США) по следующему протоколу: 2 мин при 94 °C, затем 30 циклов при 94 °C в течение 30 с, при 60 °C в течение 30 с и при 72 °C в течение 30 с. Заключительный этап элонгации проводили при 72 °C в течение 10 мин. Затем амплифицированные образцы хранили при температуре −20 °C до использования.
Анализ с помощью микрочипов
Планшет для микрочипов был разработан для обнаружения 19 видов животных: крупного рогатого скота, буйволов, кошек, кур, собак, ослов, уток, зайцев, рыб, коз, гусей, лошадей, мышей, свиней, домашней птицы, кроликов, крыс, овец и индеек.
Протокол, используемый для идентификации с помощью микрочипов, был предоставлен производителем (GeneTop, Тайвань - R.O.C.). Вкратце, ампликоны, полученные с помощью ПЦР, денатурировали нагреванием до 95 °C в течение 5 мин и 30 с, а затем помещали на лед. Предварительно нагретый (до комнатной температуры) буфер HA пипетировали заранее в каждую лунку чипа Meat-V, и жидкость распределяли по поверхности каждого чипа. В каждую лунку загружали по 5 мкл денатурированных ампликонов, после чего биочип покрывали клейкой пленкой. Биочип затем инкубировали при 50 °C в течение 40 минут в гибридизационном шейкере (1000 об/мин). Гибридизационная жидкость была удалена, а лунки были промыты три раза 200 мкл промывочного буфера. Блокирующий реагент был приготовлен с соотношением StrepAP и буфера B 1:1000, и в каждую лунку было вылито 100 мкл смеси и инкубировано 20 минут при 50 °C. Биочип промывали три раза 200 мкл промывочного буфера, затем добавляли 200 мкл буфера C и выливали. Детекционный буфер, состоящий из 2 мкл NBT/BCIP, смешанных с 98 мкл буфера C (соотношение 1:50), был добавлен в каждую лунку, и биочип был помещен в темноту на 7 минут. Детекционный буфер был удален, а чип был дважды промыт водопроводной водой. Высушенный биочип считывали с помощью ридера GeneTop (GeneTop, Тайвань - R.O.C.) и невооруженным глазом. По данным производителя, чувствительность теста составляет 0,1%. Результаты заносили в таблицу Microsoft Excel (Microsoft Corporation, Редмонд, штат Вашингтон).
Результаты
Следующие виды животных были обнаружены как минимум в одном образце протестированных кормов для домашних животных: крупный рогатый скот, курица, утка, рыба, коза, гусь, лошадь, свинина, птица, кролик, овца и индейка. Следующие виды животных не были обнаружены ни в одном образце: буйвол, кошка, собака, осёл, заяц, мышь и крыса.
Результаты, полученные с помощью ДНК-микрочипового анализа, представлены в таблице 1.
Состав 38 из 40 образцов был указан на этикетке в виде списка ингредиентов, который четко позволял идентифицировать виды включенных животных, тогда как на этикетках оставшихся двух продуктов использовались такие термины, как «животные белки» в образце с идентификатором 8 и «гидролизованные субпродукты» в образце с идентификатором 15, которые не позволяли такую идентификацию. Несмотря на их положительность для двух и пяти видов животных соответственно, поэтому было невозможно утверждать о неадекватности этикеток этих двух продуктов. Для всех остальных 38 кормов для домашних животных адекватность этикеток оценивалась следующим образом. Десять образцов (один сухой и девять влажных; семь NPD и три HPD) были маркированы правильно, поскольку была обнаружена только ДНК источника белка, указанного в списке ингредиентов (ID образцов: 14, 16, 18, 23–25, 27, 31, 35, 36). Пять образцов (один сухой и четыре влажных; четыре NPD и один HPD) были неправильно маркированы, поскольку ДНК источника белка, указанного в списке ингредиентов, не была обнаружена (ID образцов: 2, 17, 19, 28, 37); в частности, в трех образцах (ID 2, 17, 19) не была обнаружена утка, в образце ID 28 лосось, заявленный на этикетке, не вызвал положительного результата для рыбы, а в образце ID 37 гидролизованная печень птицы, указанная на этикетке, не вызвала ожидаемого положительного результата ни для курицы, ни для индейки, ни даже для птицы. В остальных 23 образцах была обнаружена ДНК источника белка, указанного в списке ингредиентов, но также была обнаружена ДНК от одного до семи других источников белка, не указанных на этикетке (рис. 1).
В таблице 2 показано количество сухих и влажных кормов для домашних животных, положительно влияющих на виды животных, не указанные на этикетке.
Наиболее часто встречающимися загрязнителями в сухих кормах для домашних животных с помощью набора для микрочипов были свинина, курица, птица и индейка, за которыми следовали говядина, рыба и овца, а затем конина; с другой стороны, наименее распространенными загрязнителями были утка и коза. Что касается влажных кормов для домашних животных, свинина была наиболее распространенным загрязнителем, за ней следовали курица, птица, индейка, говядина и овца; наименее распространенным загрязнителем была конина, в то время как рыба, утка и коза не были обнаружены в этих образцах.
Поскольку микрочип, используемый в этом исследовании, не имел лунки для обнаружения ДНК оленя, было невозможно как подтвердить наличие оленины в трех образцах, на этикетке которых были указаны эти виды, так и определить загрязнение олениной в остальных.
В целом, один сухой образец из 13 и девять влажных образцов из 25 не показали никакого загрязнения ДНК видов животных, не указанных на этикетке.
В HPD было выявлено меньше видов животных, не указанных на этикетке, чем в NPD (4 против 10, рис. 1); Более того, было обнаружено большее количество загрязненных HPD (6 из 9, 67%), чем загрязненных NPD (24 из 31, 77%). Более подробная информация представлена в таблице 3.
В HPDs наиболее распространенными загрязнителями, выявленными с помощью анализа микрочипов, были свинина, индейка, крупный рогатый скот и рыба. Свинина, курица, домашняя птица, индюшатина, крупный рогатый скот и овцы были наиболее распространенными загрязнителями в NPDs.
За исключением торговой марки L, во всех рассмотренных торговых марках был выявлен по крайней мере один продукт с неправильной маркировкой (таблица 4).
Результаты, полученные с помощью ДНК-микрочипового анализа, представлены в таблице 1.
Состав 38 из 40 образцов был указан на этикетке в виде списка ингредиентов, который четко позволял идентифицировать виды включенных животных, тогда как на этикетках оставшихся двух продуктов использовались такие термины, как «животные белки» в образце с идентификатором 8 и «гидролизованные субпродукты» в образце с идентификатором 15, которые не позволяли такую идентификацию. Несмотря на их положительность для двух и пяти видов животных соответственно, поэтому было невозможно утверждать о неадекватности этикеток этих двух продуктов. Для всех остальных 38 кормов для домашних животных адекватность этикеток оценивалась следующим образом. Десять образцов (один сухой и девять влажных; семь NPD и три HPD) были маркированы правильно, поскольку была обнаружена только ДНК источника белка, указанного в списке ингредиентов (ID образцов: 14, 16, 18, 23–25, 27, 31, 35, 36). Пять образцов (один сухой и четыре влажных; четыре NPD и один HPD) были неправильно маркированы, поскольку ДНК источника белка, указанного в списке ингредиентов, не была обнаружена (ID образцов: 2, 17, 19, 28, 37); в частности, в трех образцах (ID 2, 17, 19) не была обнаружена утка, в образце ID 28 лосось, заявленный на этикетке, не вызвал положительного результата для рыбы, а в образце ID 37 гидролизованная печень птицы, указанная на этикетке, не вызвала ожидаемого положительного результата ни для курицы, ни для индейки, ни даже для птицы. В остальных 23 образцах была обнаружена ДНК источника белка, указанного в списке ингредиентов, но также была обнаружена ДНК от одного до семи других источников белка, не указанных на этикетке (рис. 1).
В таблице 2 показано количество сухих и влажных кормов для домашних животных, положительно влияющих на виды животных, не указанные на этикетке.
Наиболее часто встречающимися загрязнителями в сухих кормах для домашних животных с помощью набора для микрочипов были свинина, курица, птица и индейка, за которыми следовали говядина, рыба и овца, а затем конина; с другой стороны, наименее распространенными загрязнителями были утка и коза. Что касается влажных кормов для домашних животных, свинина была наиболее распространенным загрязнителем, за ней следовали курица, птица, индейка, говядина и овца; наименее распространенным загрязнителем была конина, в то время как рыба, утка и коза не были обнаружены в этих образцах.
Поскольку микрочип, используемый в этом исследовании, не имел лунки для обнаружения ДНК оленя, было невозможно как подтвердить наличие оленины в трех образцах, на этикетке которых были указаны эти виды, так и определить загрязнение олениной в остальных.
В целом, один сухой образец из 13 и девять влажных образцов из 25 не показали никакого загрязнения ДНК видов животных, не указанных на этикетке.
В HPD было выявлено меньше видов животных, не указанных на этикетке, чем в NPD (4 против 10, рис. 1); Более того, было обнаружено большее количество загрязненных HPD (6 из 9, 67%), чем загрязненных NPD (24 из 31, 77%). Более подробная информация представлена в таблице 3.
В HPDs наиболее распространенными загрязнителями, выявленными с помощью анализа микрочипов, были свинина, индейка, крупный рогатый скот и рыба. Свинина, курица, домашняя птица, индюшатина, крупный рогатый скот и овцы были наиболее распространенными загрязнителями в NPDs.
За исключением торговой марки L, во всех рассмотренных торговых марках был выявлен по крайней мере один продукт с неправильной маркировкой (таблица 4).
Обсуждение
Как утверждает Европейская федерация производителей кормов для домашних животных (FEDIAF), этикетки кормов для домашних животных должны быть точными, а все ингредиенты должны быть однозначно идентифицированы. Это особенно важно для кормов, разработанных в качестве элиминационных диет для диагностики неблагоприятной пищевой реакции у собак или кошек, поскольку точность этикетки и соответствие ингредиентам, фактически входящим в состав, имеют первостепенное значение для успеха исследования.
В этом исследовании мы провели микроматричный анализ в общей сложности 40 продуктов, разработанных для диетических элиминационных испытаний с целью изучения возможных загрязнителей и неправильной маркировки. Список ингредиентов образцов ID 8 и ID 15 содержал расплывчатые указания на содержание мяса (т. е. «животные белки» и «гидролизованные субпродукты» соответственно), что исключало возможность идентификации видов животных, указанных на этикетке, только путем прочтения. Следовательно, могли быть включены любые виды животных, и хотя микроматричный анализ этих двух продуктов выявил более одного вида, невозможно с большей точностью утверждать о неадекватности продуктов. Европейский регламент (ЕС) № 767/2009 допускает указание категорий ингредиентов на этикетках кормов для домашних животных, и многие корма для домашних животных используют эту возможность. Однако расплывчатые списки ингредиентов не должны быть приемлемы для кормов для домашних животных, предназначенных для диагностики нежелательных пищевых реакций. Все оставшиеся 38 продуктов имели подробные списки ингредиентов, и виды мяса были четко указаны на их этикетках.
Согласно результатам анализа с помощью микрочипов, только 25% проанализированных препаратов были пригодны для эффективной диагностики AFR (неблагоприятной пищевой реакции). Хотя эти результаты показывают, что производство незагрязненных кормов для домашних животных возможно, три из четырех коммерческих элиминационных диет не позволили бы клиницисту установить точный диагноз AFR.
Пять неправильно маркированных образцов, заявленный вид животных которых не был выявлен микрочиповым анализом, могут быть истолкованы как коммерческое мошенничество, караемое по закону и создающее дополнительные трудности для производителей, помимо ошибочной диагностики пищевой аллергии у животных. Образцы, заявленные как содержащие утку (ID 2,17,19), вместо этого дали положительный результат как на птицу, так и на курицу и/или индейку, и это можно считать преднамеренной заменой более дешевыми ингредиентами птичьего происхождения. Случаи коммерческого мошенничества с кормами для домашних животных были описаны в предыдущем исследовании Окумы и Хеллберга, где в шести продуктах не было обнаружено видов мяса, заявленных на лицевой стороне упаковки.
С другой стороны, последствия включения неуказанных видов животных в элиминационные диеты уже были описаны ранее. В предыдущих исследованиях с помощью ПЦР-анализа было продемонстрировано наличие от одного до нескольких видов животных, не указанных на этикетке элиминационных диет, тогда как проведенный здесь микрочиповый анализ позволил идентифицировать до 19 видов животных за один запуск.
Наиболее распространенными видами животных, которые не указаны на этикетках как сухих, так и влажных кормов для домашних животных, были свинина, курица и индейка. В исследовании Хорвата-Унгербека и др., наиболее распространенными загрязнителями были говядина (положительный результат в 8/12 пробах) и свинина (положительный результат в 6/12 пробах). Поскольку свинина, птица и говядина являются видами животных, которые чаще всего убиваются в Европе для потребления человеком, именно они обеспечивают производителей кормов для домашних животных наибольшим количеством побочных продуктов животного происхождения. Учитывая, что их мясо дешевле, чем у других видов, таких как утка, оленина и козлятина, экономические причины могут указывать на частое обнаружение этих видов животных в качестве загрязняющих веществ, как предполагают Окума и Хеллберг. Это также может быть причиной того, что козы и утки были наименее часто выявляемыми видами загрязняющих животных в этом исследовании. Эти виды не были исследованы в недавнем исследовании Хорвата-Унгербека и др., в котором рассматривались только пять видов животных (курица, индейка, говядина, баранина и свинина).
Наши результаты показали, что незадекларированные виды животных чаще встречаются в сухих кормах для домашних животных, чем во влажных. Это контрастирует с результатами Okuma и Hellberg, в которых доля неправильно маркированных влажных кормов (n = 12/16) была выше, чем доля неправильно маркированных сухих кормов для домашних животных (2/17). В исследовании Риччи и др. [4], в котором использовались только сухие корма для домашних животных, сравнение сухого и влажного рационов было невозможно, в то время как Хорват-Унгербек и др. [5] проанализировали 8 сухих полноценных рационов и 4 консервированных продукта (2 полноценных и 2 дополнительных), в результате чего 6 сухих (75%) и 3 консервированных (75%) были неправильно маркированы. Одной из возможных причин более частого загрязнения, наблюдаемого в сухих продуктах, может быть то, что технологический процесс не позволяет проводить тщательную очистку между выпусками последовательных партий. Другой причиной может быть качество поступающего сырья: обезвоженные мясные полуфабрикаты, используемые при производстве сухих кормов для домашних животных, могут быть загрязнены другими мясными полуфабрикатами во время производства, транспортировки или хранения. Является ли это более существенным для мясной муки, чем для производных мяса, используемых в производстве влажных кормов для домашних животных, остаётся пока неясным.
В предыдущих исследованиях, посвященных загрязнению элиминационных рационов, HPD изучались в меньшей степени: из 12 элиминационных рационов, рассмотренных в исследовании Риччи и соавт., был выявлен только 1 HPD. и только 2 HPD в 12 кормах для домашних животных, изученных Хорватом-Унгербеком и соавторами.. В настоящем исследовании, включающем 9 исследований в области здравоохранения, можно сделать более убедительные выводы. Таким образом, можно констатировать, что в HPDS было выявлено меньше загрязняющих видов животных, чем в NPDs, и было обнаружено меньшее количество загрязненных HPDS, чем в NPDs. Даже если предположить, что производители проявляют особую осторожность при производстве HPD, нельзя исключить загрязнение гидролизованного сырья на их производственной площадке (и, следовательно, перед доставкой на завод по производству кормов для домашних животных) или во время транспортировки. Представленные результаты показали, что, даже если свинина не была указана в списке ингредиентов, пять HPD оказались положительными на ДНК свиней. На этикетке одного из этих пяти продуктов в списке ингредиентов было указано “гидролизованные субпродукты животного происхождения”, что не исключает наличия свинины; однако остальные четыре продукта были на основе курицы и/или сои. Невозможно определить, была ли обнаруженная ДНК свиньи получена из гидролизованного или негидролизованного свиного белка или даже из свиного жира; несмотря на это, эти образцы не были указаны как содержащие ДНК свиньи, и это может быть истолковано как загрязнение. Поскольку HPD используются в качестве элиминационного рациона для диагностики ARF, заражение подразумевает, что следует учитывать те же последствия, которые предполагаются для зараженных NPD. Это означает, что как HPD, так и NPD могут создавать проблемы при диагностике AFR.
Хотя для некоторых брендов было собрано всего несколько продуктов (только один продукт для четырех брендов и только два продукта для трех брендов), можно констатировать, что, как было отмечено в 13 из 14 протестированных брендов, неправильная маркировка является широко распространенным явлением.
В этом исследовании мы провели микроматричный анализ в общей сложности 40 продуктов, разработанных для диетических элиминационных испытаний с целью изучения возможных загрязнителей и неправильной маркировки. Список ингредиентов образцов ID 8 и ID 15 содержал расплывчатые указания на содержание мяса (т. е. «животные белки» и «гидролизованные субпродукты» соответственно), что исключало возможность идентификации видов животных, указанных на этикетке, только путем прочтения. Следовательно, могли быть включены любые виды животных, и хотя микроматричный анализ этих двух продуктов выявил более одного вида, невозможно с большей точностью утверждать о неадекватности продуктов. Европейский регламент (ЕС) № 767/2009 допускает указание категорий ингредиентов на этикетках кормов для домашних животных, и многие корма для домашних животных используют эту возможность. Однако расплывчатые списки ингредиентов не должны быть приемлемы для кормов для домашних животных, предназначенных для диагностики нежелательных пищевых реакций. Все оставшиеся 38 продуктов имели подробные списки ингредиентов, и виды мяса были четко указаны на их этикетках.
Согласно результатам анализа с помощью микрочипов, только 25% проанализированных препаратов были пригодны для эффективной диагностики AFR (неблагоприятной пищевой реакции). Хотя эти результаты показывают, что производство незагрязненных кормов для домашних животных возможно, три из четырех коммерческих элиминационных диет не позволили бы клиницисту установить точный диагноз AFR.
Пять неправильно маркированных образцов, заявленный вид животных которых не был выявлен микрочиповым анализом, могут быть истолкованы как коммерческое мошенничество, караемое по закону и создающее дополнительные трудности для производителей, помимо ошибочной диагностики пищевой аллергии у животных. Образцы, заявленные как содержащие утку (ID 2,17,19), вместо этого дали положительный результат как на птицу, так и на курицу и/или индейку, и это можно считать преднамеренной заменой более дешевыми ингредиентами птичьего происхождения. Случаи коммерческого мошенничества с кормами для домашних животных были описаны в предыдущем исследовании Окумы и Хеллберга, где в шести продуктах не было обнаружено видов мяса, заявленных на лицевой стороне упаковки.
С другой стороны, последствия включения неуказанных видов животных в элиминационные диеты уже были описаны ранее. В предыдущих исследованиях с помощью ПЦР-анализа было продемонстрировано наличие от одного до нескольких видов животных, не указанных на этикетке элиминационных диет, тогда как проведенный здесь микрочиповый анализ позволил идентифицировать до 19 видов животных за один запуск.
Наиболее распространенными видами животных, которые не указаны на этикетках как сухих, так и влажных кормов для домашних животных, были свинина, курица и индейка. В исследовании Хорвата-Унгербека и др., наиболее распространенными загрязнителями были говядина (положительный результат в 8/12 пробах) и свинина (положительный результат в 6/12 пробах). Поскольку свинина, птица и говядина являются видами животных, которые чаще всего убиваются в Европе для потребления человеком, именно они обеспечивают производителей кормов для домашних животных наибольшим количеством побочных продуктов животного происхождения. Учитывая, что их мясо дешевле, чем у других видов, таких как утка, оленина и козлятина, экономические причины могут указывать на частое обнаружение этих видов животных в качестве загрязняющих веществ, как предполагают Окума и Хеллберг. Это также может быть причиной того, что козы и утки были наименее часто выявляемыми видами загрязняющих животных в этом исследовании. Эти виды не были исследованы в недавнем исследовании Хорвата-Унгербека и др., в котором рассматривались только пять видов животных (курица, индейка, говядина, баранина и свинина).
Наши результаты показали, что незадекларированные виды животных чаще встречаются в сухих кормах для домашних животных, чем во влажных. Это контрастирует с результатами Okuma и Hellberg, в которых доля неправильно маркированных влажных кормов (n = 12/16) была выше, чем доля неправильно маркированных сухих кормов для домашних животных (2/17). В исследовании Риччи и др. [4], в котором использовались только сухие корма для домашних животных, сравнение сухого и влажного рационов было невозможно, в то время как Хорват-Унгербек и др. [5] проанализировали 8 сухих полноценных рационов и 4 консервированных продукта (2 полноценных и 2 дополнительных), в результате чего 6 сухих (75%) и 3 консервированных (75%) были неправильно маркированы. Одной из возможных причин более частого загрязнения, наблюдаемого в сухих продуктах, может быть то, что технологический процесс не позволяет проводить тщательную очистку между выпусками последовательных партий. Другой причиной может быть качество поступающего сырья: обезвоженные мясные полуфабрикаты, используемые при производстве сухих кормов для домашних животных, могут быть загрязнены другими мясными полуфабрикатами во время производства, транспортировки или хранения. Является ли это более существенным для мясной муки, чем для производных мяса, используемых в производстве влажных кормов для домашних животных, остаётся пока неясным.
В предыдущих исследованиях, посвященных загрязнению элиминационных рационов, HPD изучались в меньшей степени: из 12 элиминационных рационов, рассмотренных в исследовании Риччи и соавт., был выявлен только 1 HPD. и только 2 HPD в 12 кормах для домашних животных, изученных Хорватом-Унгербеком и соавторами.. В настоящем исследовании, включающем 9 исследований в области здравоохранения, можно сделать более убедительные выводы. Таким образом, можно констатировать, что в HPDS было выявлено меньше загрязняющих видов животных, чем в NPDs, и было обнаружено меньшее количество загрязненных HPDS, чем в NPDs. Даже если предположить, что производители проявляют особую осторожность при производстве HPD, нельзя исключить загрязнение гидролизованного сырья на их производственной площадке (и, следовательно, перед доставкой на завод по производству кормов для домашних животных) или во время транспортировки. Представленные результаты показали, что, даже если свинина не была указана в списке ингредиентов, пять HPD оказались положительными на ДНК свиней. На этикетке одного из этих пяти продуктов в списке ингредиентов было указано “гидролизованные субпродукты животного происхождения”, что не исключает наличия свинины; однако остальные четыре продукта были на основе курицы и/или сои. Невозможно определить, была ли обнаруженная ДНК свиньи получена из гидролизованного или негидролизованного свиного белка или даже из свиного жира; несмотря на это, эти образцы не были указаны как содержащие ДНК свиньи, и это может быть истолковано как загрязнение. Поскольку HPD используются в качестве элиминационного рациона для диагностики ARF, заражение подразумевает, что следует учитывать те же последствия, которые предполагаются для зараженных NPD. Это означает, что как HPD, так и NPD могут создавать проблемы при диагностике AFR.
Хотя для некоторых брендов было собрано всего несколько продуктов (только один продукт для четырех брендов и только два продукта для трех брендов), можно констатировать, что, как было отмечено в 13 из 14 протестированных брендов, неправильная маркировка является широко распространенным явлением.
Выводы
В заключение, анализ микрочипов показал, что при исследовании 38 кормов для домашних животных, разработанных для диагностики AFR у собак и кошек, 3 из 4 были загрязнены от одного до семи видов источников белка, не указанных на этикетке. Эта проблема, по-видимому, касается как новых источников белка, так и гидролизированных белковых диет, при этом в первых было обнаружено большее количество видов животных-загрязнителей. Кроме того, загрязнение, по-видимому, чаще встречается в сухих продуктах, чем влажных, независимо от производителя кормов для домашних животных. Особое внимание следует уделять как производственному процессу из-за высокого риска перекрестного загрязнения, так и выбору поставщиков сырья. Учитывая это, данные результаты отражают загрязнение только собранных здесь партий, и, следовательно, неправильная маркировка конкретного продукта не может быть распространена ни на предыдущие, ни на будущие производственные партии данного производителя. Важно отметить, что данное исследование демонстрирует возможность производства незагрязненных продуктов, что подтверждается десятью кормами для домашних животных (26%), маркировка которых, согласно результатам анализа, была корректной. При подозрении на неблагоприятную пищевую реакцию разумной альтернативой коммерческим продуктам может стать элиминационная диета домашнего приготовления, поскольку она позволяет более строго контролировать потребляемые ингредиенты и значительно снижает риск попадания загрязняющих веществ, которые могут помешать правильной диагностике AFR.